克隆资料(干细胞克隆猪取得突破)

克隆资料(干细胞克隆猪取得突破)

经过三次基因编辑的干细胞克隆小猪。 (资料图/图)

家畜干细胞在生命科学基础研究、细胞培养人造肉生产和优良品种培育等方面具有巨大应用前景。自1981年小鼠胚胎干细胞获得成功以来,科学家一直试图建立稳定的、可长期传代的大家畜胚胎多能干细胞系,但始终未获得成功。最近中国农业大学韩建永教授团队联合国内多家单位获得重大突破,成功建立了目前世界家畜干细胞传代次数最多(传代260次以上)、可进行连续多次基因编辑操作的猪胚胎干细胞系,在国际上首次获得多轮基因编辑的干细胞克隆猪,攻克了猪胚胎上胚层多能干细胞建系的国际难题。2021年11月30日,该研究成果在线发表在国际著名学术期刊《细胞研究》(Cell Research)上。

家畜胚胎干细胞建系

胚胎干细胞是从动物胚胎发育早期分离出来的一类多能干细胞,具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上,胚胎干细胞可以分化为动物体任何细胞类型,并能发育成完整个体。人类胚胎干细胞主要用于损伤或疾病后的再生医学和组织置换等领域,而家畜胚胎干细胞则可用于基因修饰动物的制备、器官移植和家畜育种等领域。

1981年,英国剑桥大学马丁·埃文斯等人从小鼠早期胚胎中分离出第一种哺乳动物的胚胎干细胞。除了一些在生命科学基础研究领域的应用之外,小鼠胚胎干细胞最引入瞩目的应用是在制备基因敲除小鼠上。1989年,美国科学家奥利弗·史密斯和马里奥·卡佩奇分别独立利用小鼠胚胎干细胞成功培育出第一批基因敲除小鼠,开创了动物功能基因研究和医学动物模型研究的新纪元。2007年,三位科学家共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。不过哺乳动物的胚胎干细胞分离和建系难度非常大,直到1998年,美国威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员才分离获得第二种哺乳动物的胚胎干细胞,即人胚胎干细胞,掀起了胚胎干细胞治疗的研究热潮。

相对于小鼠和人类胚胎干细胞,家畜胚胎干细胞研究之路更加曲折。经过四十年的探索,国内外的科学家在家畜胚胎干细胞研究领域进展仍然非常有限。培育的所谓家畜胚胎干细胞,要么是难以达到小鼠和人类胚胎干细胞的标准,往往只具有胚胎干细胞部分特性,要么是传代次数偏少,而且经不起折腾,无法耐受多次转基因、基因编辑操作,难以制备出健康存活的基因修饰动物。

稳定传代超过二百次

猪既是重要的肉食家畜,也是重要的实验动物,在基础研究、人类疾病模型、异种器官移植等领域用途广泛。针对家畜胚胎上胚层多能干细胞建系困难,传代次数短,难以承受多次基因编辑操作等国际难题,中国农业大学韩建永团队联合四川农业大学、中国科学院动物研究所、中国科学院北京基因研究所、东北农业大学等单位,以猪为模式生物,开展了联合科技攻关,取得家畜胚胎干细胞领域的重大突破。

研究人员从早期胚胎多能性发育调控分子机制入手,攻克了猪早期胚胎单细胞分离技术,首次绘制了猪胚胎第0-14天(完整的附植前阶段)高质量单细胞转录组图谱,成功解析了猪上胚层多能性状态(初始态、中间态和激发态)变化及调控的分子机制,并发现猪胚胎外胚层的增殖和维持需要激活素A和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的存在,这也是小鼠和人类胚胎干细胞自我更新所必需的。

在上述研究的基础上,研究人员推测猪胚胎发育的第8-10天是形成多能干细胞的理想阶段。他们研发出一种可显著维持多能干细胞状态的培养基,创制了猪上胚层多能干细胞培养体系,成功利用第10天的胚胎上胚层细胞建立15株胚胎干细胞系,细胞能够维持上胚层多能性状态,具有典型干细胞特征。这些胚胎干细胞可以在不发生任何分化的情况下稳定传代240代以上,最多传代次数可达260代,这是目前世界上已报道传代次数最多的大动物干细胞系,解决了家畜胚胎干细胞传代次数少的难题。

研究人员对猪上胚层多能干细胞进行了多组学联合分析,其中通过高通量染色质构象捕获(Hi-C)测序技术构建了猪上胚层多能干细胞的基因组结构三维,发现猪上胚层多能干细胞的染色质结构松散,是其具有较强细胞分化能力的重要原因。研究人员还鉴定出75个与猪上胚层多能干细胞保持多能性等功能高度相关的转录因子,为后续猪多能干细胞调控机制研究奠定了重要基础。

为了检测所建立的猪上胚层多能干细胞系是否支持耐受多轮基因操作,研究人员对猪上胚层多能干细胞系进行了三次连续的基因操作,第一次基因操作是采用基因转染的方式将绿色荧光蛋白基因随机整合到干细胞基因组中,第二次基因操作是采用CRISPR/Cas9将外源基因定点插入到基因组指定位置,第三次基因操作则是采用单碱基编辑器对一个影响毛色的基因进行了碱基C到T的置换。经过三轮基因操作之后,干细胞仍然保持较好的状态。接下来,研究人员以经过三次基因编辑的干细胞系为供体细胞,通过核移植技术,获得来源于猪上胚层多能干细胞、出生存活的基因编辑克隆猪,解决了家畜胚胎干细胞难以承受长周期、连续多次基因编辑的国际难题。

广阔的应用前景

该研究首次建立了可稳定传代240次以上的猪胚胎干细胞系,并成功获得经过多次基因编辑操作的克隆猪,在生命科学基础研究、细胞培养肉生产、医学动物模型、家畜干细胞育种等领域具有广阔的潜在用途。

在生命科学基础研究领域,作为一种全新的、稳定的胚胎多能干细胞系,猪上胚层多能干细胞成功建系,开创了家畜多能干细胞研究的新方向。与小鼠相比,猪的胚胎发育和人类更加相似,猪的胚胎干细胞是研究人类胚胎发育更为理想的细胞模型。通过猪、人、小鼠等不同物种的多能干细胞比较,能够发现干细胞多能性维持的物种间差异性和统一性,为异种器官移植等再生医学研究提供理论依据。

在细胞培养肉领域,猪上胚层多能干细胞可作为未来细胞培养等基于细胞的功能性产品的种子细胞。目前细胞培养肉研制的种子细胞多为肌肉和脂肪细胞的祖细胞,并不具有长期传代增殖能力,成为体外大规模生产细胞培养肉的技术瓶颈。猪上胚层多能干细胞能够在体外长期稳定传代,通过体外大规模培养,获得大量初始细胞,再通过定向诱导分化获得肌肉细胞和脂肪细胞,可以解决“种子细胞”传代时间短等细胞培养肉的技术难题。

在医学模式动物研究领域,猪上胚层多能干细胞与基因编辑结合,可用于构建人类疾病模型或异种器官移植。目前使用猪体细胞核移植的主要限制之一是供体细胞通常只能支持一次基因组编辑,难以同时获得多基因编辑克隆家畜,通常需要采用重复性克隆和重新分离成纤维细胞,才能实现多轮基因编辑,周期短,效率低。实验证实猪上胚层多能干细胞对基因编辑有很好的耐受性,至少可以耐受三次连续的基因编辑,这将大大减少制备多基因编辑克隆猪的时间和成本。

在家畜优良品种培育领域,猪上胚层多能干细胞通过定向诱导分化为精子和卵母细胞可以实现干细胞育种。胚胎干细胞可以在体外诱导完成配子发育的整个过程,形成有功能的精子或卵母细胞。将干细胞与基因组测序和基因组选择等技术结合,再通过体外生殖细胞诱导和体外受精,获得子代胚胎,结合基因组选择技术,可以在实验室中完成优良家畜胚胎的批量生产和精准选择,实现家畜干细胞育种,可显著缩短世代间隔和提高选择强度,快速获得30-40倍的遗传增益,实现重要经济性状的快速遗传改良。

不过,从猪胚胎干细胞建系成功到细胞培育肉、干细胞育种等产业化应用,还需要进一步深入研究,重点解决效率、成本等问题。

南方周末特约撰稿 汤波